Производство гистона и бетасерона

Производство гистона и бетасерона

Предложен пример промышленного производства терапевтических белков с резко выраженными основными свойствами по универсальной схеме. Это белки небольшой молекулярной массы (11-24 кДа). Их щелочной характер определяется высоким содержанием лизина и аргинина. В результате чего, изоэлектрическая точка таких белков колеблется в интервале значений от 9 до 12. Наибольший интерес вызван к таким белкам, как гистоны и бетасерон.

Гистон Н1 - один из 5 основных гистонов, который взаимодействует с участком ДНК, непосредственно не контактирующим с гистоновым октамером (линкерной ДНК), и способствует конденсации хроматина с образованием структур размером ~30 нм, т. е другими словами это ядерный белок клетки, необходимый для сборки и упаковки нитей ДНК в хромосомы.  В геноме человека было обнаружено 8 различных гистоновых белков H1. Гистон H1.3 являются в настоящее время перспективным биофармацевтическим объектом. Препараты на  основе рекомбинантного гистона Н1.3 (нарабатывается в культуре бактериальных клеток E. Coli) предложено использовать в терапии острого миелоидного лейкоза.

Бетасерон (интерферон β-1b, IFN β-1b) -  рекомбинантный аналог природного человеческого интерферона β. Препараты на его основе представляет большой интерес для терапии рассеянного склероза. Сегодня существует 2 типа препаратов интерферона β, используемых для лечения рассеянного склероза – это IFN β-1b (препарат Бетаферон) и IFN β-1а (препарат Ребиф). Все препараты получены методом рекомбинантного синтеза.  IFN β-1а нарабатываются в культуре клеток яичника китайского хомячка, а IFN β-1b – в культуре бактериальных клеток E. Coli. Сравнительный анализ этих двух препаратов показал, что клинический эффект препарата зависит от дозы и кратности введения лекарственного средства. Высокие дозы IFN β-1b, вводимые 3 раза в неделю более эффективны, чем низкие (IFN β-1a), вводимые 1 раз в неделю.

В основе организуемого производства заложены методы и приёмы биотехнологии, базирующиеся на технологии рекомбинантных ДНК с последующей очисткой и формуляцией продукта.

В качестве продуцентов предлагаются прокариотические (бактериальные системы экспрессии). Для производства данных лекарственных средств предлагается общая схема, что значительно удешевляет производство и стандартизует процедуру документирования технологического процесса в соответствии с требованиями GMP.

На первом этапе конструируются плазмиды, детерминирующие синтез гистона и интерферона. Сконструированные плазмиды внедряются в штамм кишечной палочки E.coli, например, BL21 DE3.  В результате, получают штамм-продуценты, обеспечивающие синтез белков не менее 2000 мг с 1л КЖ.

Схема получения данных белков на технологическом уровне включает в себя культивирование штамма-продуцента (ферментацию), сбор клеток, разрушение клеток под действием высокого давления (дезинтеграция), отделение (сепарация) полученных так называемых “телец включения”, содержащих рекомбинантный белок. ТВ подвергают последовательно ряду обработок: Рекомбинантный белок сначала экстрагируют 50-60% 1-пропанолом с 0,2 % ТФУ, затем проводят осаждение белка из экстракта посредством разведения и защелачивания до рН 7.0. Экстракт осветляют центрифугированием. Полученный осадок белка растворяют в 1% лаурате натрия с последующей ренатурацией ионами Cu2+. Далее проводят гель-фильтрацию на сорбенте Sephadex G-25 для удаления детергента. Белок снова высаживают, центрифугируют и высвобождают от эндотоксинов методом мицелляроной экстракции Triton X-114 и   очищают методами ОФ ВЭЖХ на сорбентах Phenomenex С4 и С18.  Конечная гель-фильтрация применяется для смены буферной системы и получения, и приготовления субстанции.

Задачей 1-й ОФ ВЭЖХ является концентрирование и очистка белка от родственных примесей, белков клетки-хозяина и ДНК. Затем с помощью 2-й ОФ ВЭЖХ белки полностью освобождают от белков клетки-хозяина и остаточных эндотоксинов.  Применение мицеллярной экстракции и экстракции белка из ТВ пропиловым спиртом является основным залогом успеха получения фармацевтически чистых лекарственных препаратов.

Время одного производственного цикла составляет 1 неделю.


Технологическая схема производства гистона и бетасерона

№ Стадии

Название стадии

Графическая интерпритация стадии

Цель выполнения стадии

1 Культивирование штамма-продуцента (ферментация) Штамм-продуценты, обеспечивают синтез каждого белка не менее 2000 мг с 1л культуральной жидкости.
2 Дезинтеграция Разрушение клеток под действием высокого давления
3 Сепарация Сбор разрушенных клеток, содержащих "тельца включения"
4 Экстракция белка из телец включения  Высвобождение белка из «телец включения» методом твердофазной экстракции. Экстрагент 50-60 % пропиловый спирт селективно извлекает белок из ТВ, тем самым происходит первичная основная очистка от клеточных и родственных примесей
5 Сепарация Осветление экстракта
6 Осаждение целевого белка Проводится посредством приливания фосфатного буферного раствора
7 Центрифугирование Сбор и промывка белкового осадка фосфатным буферным раствором
8 Ренатурация Растворение осадка в ионном детергенте.
Формирование нативной структуры и замыкание дисульфидных связей с помощью сульфата меди
9 Гель-хроматография Очистка целевого белка от детергента, смена буферной системы
10 Осаждение целевого белка Проводится посредством приливания фосфатного буферного раствора
11 Центрифугирование Сбор и промывка белкового осадка фосфатным буферным раствором
12 Экстракция в системе жидкость-жидкость  Очистка белка от остаточных эндотоксинов и разрушение комплекса белок-белок клетки хозяина
методом мицеллярной экстракции с помощью детергента Тритона X-114
13 ОФ ВЭЖХ на колонке, упакованной сорбентом C4 Концентрирование и очистка целевого белка от белков клетки-хозяина.
Подвижная фаза А: B-Вода: Ацетонитрил+1-Пропанол
14 ОФ ВЭЖХ
на колонке, упакованной сорбентом C18
Рехроматография целевого белка
для удаления белков клетки-хозяина и родственных примесей.
Подвижная фаза А: B-Вода: Ацетонитрил
15 Гель-хроматография Очистка целевого белка от следовых количеств детергента 
16 Гель-хроматография Создание конечной альбумин-содержащей формуляции
17 Фильтрация, розлив, укупорка, этикировка Получение ГЛФ

Номер стадии

Название стадии

Наименование оборудования

Фирма изготовитель

Изображение

Количество

1

Культивирование

Ферментер промышленный Solaris I-series, 1000л

Solaris

1

Ферментер промышленный Solaris М-series, 100л

1

Ферментер промышленный Solaris S-series, 20 л

1

Ламинарный шкаф HERAguard ECO 1.8/95

Thermo Scientific

1

Шейкер -инкубатор Multitron Standard

Infors NT

1

Мебель лабораторная серии евроэксперт

Эксперт

 

2

Дезинтеграция

Гомогенизатор AVP Rannie 24 / Gaulin 24, 300 бар

SPXflow

1

3

Сепарация

Сепаратор BTAX215

Alfa Laval

1

4

Экстракция белка из телец включения

Экстракторы серии Timatic Maxi , 200 л

Tecnolab

2

Емкость с верхнеприводной мешалкой, 1500 л

Patent

1

Емкость с верхнеприводной мешалкой, 1000 л

1

5

Cепарация

Сепаратор BTAX215

Alfa Laval

1

6, 10

Осаждение целевого белка

Сосуды для смешения BuchiGlasUster, 500 л

Buchi

4

7,  11

Cепарация


Высокоскоростные центрифуги CEPA серии Z 101

CEPA

1

Насос с гибким импеллером INOXPA RF

INOXPA

1

8

Ренатурация

Сосуды для смешения BuchiGlasUster, 250 л

Buchi

1

9

Гель-фильтрация

ÄKTAprocess 10 mm i.d. PP,  15–600 l/h

GE

1

Хроматографическая колонна BPG 450х500 мм

1

Емкость для подвижной фазы Xcellerex XDUO 2500

1

Емкость для сбора фракции с верхнеприводной мешалкой, 1000 л

Patent

1

12

Экстракция в системе жидкость-жидкость

Емкость из нержавеющей стали, 200 л, с возможностью термостатирования

 

Patent

 

1

Емкость из нержавеющей стали,100 л, с возможностью термостатирования

1

13

ОФ ВЭЖХ на колонке, упакованной сорбентом C4

Prochrom  HiperSEP  HPLC System

Novasep

1

Prochrom HPLC columns,  V 15 л

1

Емкость для подвижной фазы, коническая, 500л

Patent

1

Емкость для подвижной фазы, коническая, 100л

1

Емкость для сбора фракции с верхнеприводной мешалкой, 100 л

Patent

1

14

ОФ ВЭЖХ
на колонке, упакованной сорбентом C18

Prochrom  HiperSEP  HPLC System

Novasep

1

Prochrom HPLC columns,  V 15 л

1

Емкость для подвижной фазы, коническая, 500л

Patent

1

Емкость для подвижной фазы, коническая, 100л

1

Емкость для сбора фракции с верхнеприводной мешалкой, 100 л

Patent

1

15

Гель-фильтрация

ÄKTAprocess 10 mm i.d. PP,  15–600 l/h

GE

1

Хроматографическая колонна BPG 300х750 мм

1

Емкость для подвижной фазы Xcellerex XDUO 2500

1

Емкость для сбора фракции с верхнеприводной мешалкой, 100 л

Patent

1

16

Гель-фильтрация

ÄKTAprocess 10 mm i.d. PP,  15–600 l/h

GE

1

Хроматографическая колонна BPG 300х750 мм

1

Емкость для подвижной фазы Xcellerex XDUO 2500

1

Емкость для сбора фракции с верхнеприводной мешалкой, 1500 л

Patent

1

Этап трансфера подразумевает передачу промышленных (прошедших предварительное масштабирование всех процессов) технологий на производство. На данном этапе подбирают промышленное оборудование в соответствии с технологическими процессами.

Согласно, приведенной схеме предложено промышленное оборудование (см.  подбор оборудования), обеспечивающее максимальный выход целевых белков за 1 производственный цикл (7 дней).  Для расчетов предположили, что годовой бюджет эффективного рабочего времени при 5-дневной (40 ч) рабочей неделе составит 204 рабочих дня (из 365 вычитается 104 выходных и 33 предпраздничных, праздничных дней, новогодних и майских каникул, и 24 дня отпуска). Таким образом, при использовании стандартного оборудования технология позволяет наладить выпуск, примерно 12-15 кг белков в год т.е. провести 30 циклов производства (см. Технологическую схему), что полностью перекрывает потребность в данных препаратах.

Данное решение позволяет:

  • Удешевить производство двух препаратов и стандартизовать процедуру документирования технологического процесса в соответствии с требованиями GMP за счет общей схемы производства;
  • Закрыть годовую потребность в препарате интерферона β-1b в очень короткие сроки;
  • Получить уникальное лекарственное средство  для использования в терапии миелоидного лейкоза.
Оборудование в лизинг
«Фармконтракт Инжиниринг»