Эффективное производство инсулина

Решение по организации промышленного производства инсулина

Предложен пример совместного производства лекарственных препаратов инсулина, соматропина, филграстима (и ПЭГ-аналога), интерферона альфа (и ПЭГ-аналога) по общей схеме производства по технологии полного цикла.

Инсулин – гормон поджелудочной железы, регулирующий углеводный обмен и поддерживающий нормальный уровень сахара в крови. Недостаток этого гормона в организме приводит к одному из тяжелейших заболеваний – сахарному диабету, который как причина смерти стоит на третьем месте после сердечно-сосудистых заболеваний и рака.

Гормон роста человека (ГРЧ, соматотропин) – это гормон гипоталамуса, который вырабатывается передней долей гипофиза. Играет важную роль в метаболизме, увеличении массы, уменьшении количества жира в организме, отвечает за рост костей и тканей. Дефицит гормона приводит к карликовости и такому заболеванию как гипофизарный нанизм.

Филграстим - это гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (цитокин). Играет важную роль в регуляции гранулоцитопоэза и ответственен за образование функционально активных нейтрофилов и их выход в кровь из костного мозга. Применяется при фебрильной нейтропении любой этиологии.

Интерфероны — это белки, которые вырабатываются клетками организма при внедрении в них вирусов. Сами интерфероны не подавляют развитие вирусов, но они запускают сложный механизм биологических процессов в клетках, в результате которых активизируются гены, кодирующие синтез множества белков, обеспечивающих противовирусное действие, а также другие эффекты, вызываемые интерферонами. При этом подавляется синтез белков вирусов и вирус не может размножаться

Получение лекарственных препаратов методами генной инженерии является сегодня приоритетным направлением в развитии такой важной отрасли, как биотехнология. Одним из путей быстрого развития является производство дженериков. Разработка таких технологий и организация собственного масштабного производства позволит быстро освоить современное оборудование, приобрести опыт работы в условиях GMP, изучить различные методы анализа и очистки, добиться высокого качества выпускаемого продукта, обеспечить необходимыми препаратами большее количество пациентов и заложить основы импортозамещения.

В основе организуемого производства заложены методы и приёмы биотехнологии, базирующиеся на технологии рекомбинантных ДНК с последующей очисткой и формуляцией продукта.

В качестве продуцентов предлагаются прокариотические (бактериальные системы экспрессии). Для производства данных лекарственных средств предлагается общая схема, что значительно удешевляет производство и стандартизует процедуру документирования технологического процесса в соответствии с требованиями GMP.

На первом этапе конструируются плазмиды, детерминирующие синтез проинсулина, Met-СМТ, Met-интерферона α2b(2a), филграстима. Сконструированные плазмиды внедряются в штамм кишечной палочки E.coli, например, BL21.  В результате, получают штамм-продуценты, обеспечивающие синтез белков не менее 1800 мг с 1л КЖ.

Схема получения данных белков на технологическом уровне включает в себя культивирование штамма-продуцента (ферментацию), сбор клеток, разрушение клеток под действием высокого давления (дезинтеграция), отделение (сепарация) полученных так называемых “телец включения”, содержащих рекомбинантный белок. ТВ подвергают последовательно ряду обработок: Рекомбинантный белок сначала восстанавливают, затем ренатурируют и очищают методами ионообменной (ИОХ) и гидрофобной (ХГВ) хроматографиями на Q или SP-Sepharose и на Butyl-Sepharose соответственно. Гель-фильтрация применяется для смены буферной системы и получения субстанции.

После первой стадии ИОХ проводят ферментативное расщепление инсулина (отщепление пропептида и С-пептида) или отщепление N-концевого метионина лейциновой аминопептидазой у соматропина (интерферона альфа) или проводится пэгилирование филграстима и интерферона. Задачей первой ИОХ является концентрирование, основная очистка от всех примесей (эндотоксины, ДНК, дезамидированные формы и др. родственные примеси), затем с помощью ХГВ целевые белки полностью освобождают от белков клетки-хозяина и остаточных эндотоксинов и в конце очистки - ИОХ-2 удаляют окисленные формы метионина и остаточные дезамидированные формы.  Понижение рН в процессе очистки является основным залогом успеха получения фармацевтически чистых лекарственных препаратов.

Время одного производственного цикла составляет 1 неделю.


Технологическая схема производства инсулина и других белков

№ Стадии

Название стадии

Графическая интерпритация стадии

Цель выполнения стадии

1 Культивирование штамма-продуцента (ферментация) Штамм-продуценты, обеспечивают синтез каждого белка не менее 2000 мг с 1л культуральной жидкости.
2 Дезинтеграция Разрушение клеток под действием высокого давления
3 Сепарация Сбор разрушенных клеток, содержащих "тельца включения"
4 Солюбилизация Высвобождение белка из «телец включения»
5 Ренатурация Формирование нативной структуры и замыкание дисульфидных связей
6 Ионообменная хроматография Концентрирование белка, основная очистка от всех примесей (эндотоксины, белки E.coli, ДНК, родственные примеси)
7 Ферментативная обработка Ферментативное расщепление инсулиновой цепи, отщепление метионина у других белков или пэгилирование
8 Хроматография гидрофобных взаимодействий Финишная очистка целевого белка от белков клетки-хозяина E.coli
9 Гель-хроматография Смена буферной системы
10 Ионообменная хроматография Финишная очистка целевого белка от эндотоксинов, и родственных примесей
11 Гель-хроматография Смена буферной системы
12 Фильтрация, розлив, укупорка, этикировка Получение ГЛФ

Номер стадии

Название стадии

Наименование оборудования

Фирма изготовитель

Изображение

Количество

1

Культивирование

Биореактор бактериальный 3000 л , Techfors

Infors

2

Биореактор бактериальный 1000 л , Techfors

1

Биореактор бактериальный 200 л , Techfors

1

Биореактор бактериальный 50 л , Techfors

1

Биореактор бактериальный 15/10 , Techfors-S

1

2 и 4

Сепарация

Сепаратор BTAX215

Alfa Laval

1

5

Дезинтеграция

Гомогенизатор APV Rannie 24 / Gaulin 24, 300 бар

SPXflow

1

6

Солюбилизация

Емкость с верхнеприводной мешалкой, 500 л со встроенным насосом Grundfos 1500л/час

Patent

1

7

Ренатурация

Емкость с верхнеприводной мешалкой, 3000 л

1

9

Ферментативная обработка

Емкость с верхнеприводной мешалкой, 1000 л

1

8,10-13

Хроматографическая очиска

ÄKTAprocess 10 mm i.d. PP,  15–600 l/h

GE Healthcare

5

Емкости для подвижной фазы

Xcellerex XDUO 2500

4

Xcellerex XDM Quad Single-Use Mixing System 1000

1

Xcellerex XDM Quad Single-Use Mixing System 500

3

Хроматографическая колонна

BPG 450 мм х 750 см

2

BPG 450 мм х 500 см

1

AxiChrom 1200 мм х 500 см

2

Этап трансфера подразумевает передачу промышленных (прошедших предварительное масштабирование всех процессов) технологий на производство. На данном этапе подбирают промышленное оборудование в соответствии с технологическими процессами.

При использовании стандартного оборудования технология позволяет наладить выпуск, примерно 30 кг инсулина в год, т.е. провести 30 циклов производства.

Ограничения:

  • Оборудование используется без перерыва на решение различных технических вопросов;
  • Выход из строя любого узла срывает выпуск продукта;
  • Невозможен выпуск других препаратов;

Решение: Запустить параллельно две одинаковые технологические линии.

Данное решение:

  1. Позволяет за 6 циклов закрыть годовую потребность страны в препаратах соматропина, филграстима, интерферона  альфа и повысить выход инсулина до 50 кг/год;
  2. Обеспечивает гибкость процесса и снижает себестоимость инсулина за счет более дорогих препаратов;
Оборудование в лизинг
«Фармконтракт Инжиниринг»