Системы INFORS HT позволяют увеличить выход рекомбинантного белка

Системы INFORS HT позволяют увеличить выход рекомбинантного белка

Рекомбинантные белки пользуются все более возрастающим спросом. На фоне этого возникает потребность в новых решениях для качественного культивирования и скрининга, которые отличаются высокой производительностью. Это особенно актуально в случаях, когда клетки сложно адаптировать к культивированию в планшетах на 96 ячеек, так как для этого требуется большое количество кислорода и углекислого газа.

INFORS HT нашла практичный выход из этого положения, предоставив на рынок инновационный шейкер инкубаторного типа, который обеспечивает перемешивание с амплитудой 3 мм. При этом устанавливается скорость 800-1000 мин-1. С его помощью возможно увеличить выход рекомбинантных белков в значительной мере. При этом уменьшается разброс данных — особенно если сравнивать с более привычным культивированием при амплитуде 25 мм. Этот шейкер создает условия для быстрого роста и увеличения продолжительности жизни культур благодаря оптимальной циркуляции рабочей среды. При этом инкубатор способен вместить до 40 планшетов на 96 лунок за счет правильно подобранных уплотнений и платформ. В итоге производитель получил полностью автоматизированную систему с высокой производительностью для экспрессии белка, благодаря которой процесс значительно сокращается по времени.

Как проводились испытания системы

Для экспериментов использовалось следующие условия:

  • клеточная линия – 293E и HEK293 (суспензионно адаптированного типа);
  • посевная и рабочая среда: F-17 и SFM4 Transfix, соотношение 1:1;
  • температура: 37 °C;
  • содержание углекислого газа: 5%;
  • перемешивание: на скорости 150 мин-1;
  • трансфекция: с участием 25-kDa линейного PEI и плазмидной ДНК высокой очистки.

Для проведения испытаний перед запуском систем в производство использовались планшеты Greiner Bio-One Masterblock, рассчитанные на 96 ячеек. Перемешивание производилось при 800 и 1000 мин-1. Эксперименты проводились в двух типах объемов — 500 и 1000 мкл. Трансфекция производилась в объеме 50 мл, из которого отбиралась аликвота, распределяемая по лункам планшета.

После этого пробы помещались в инкубатор и по истечении определенного времени извлекались и отправлялись на центрифугу для осветления. Для определения белковой экспрессии в супернатанте использовалась ВЭЖХ.

Как производились основные измерения

Клеточные пробы отбирались каждый день на протяжении недели культивирования. Полученный супернатант помещался в аффинный хроматограф (производитель Agilent Technologies) для определения белковой концентрации.

После этого велось сравнение результатов двух типов перемешивания образцов, помещенных в инкубатор:

  • при амплитуде 25 мм выход белка в среднем получался в пределах 33 мкг/мл;
  • при амплитуде 3 мм, которая обеспечивалась шейкером инкубаторного типа INFORS HT Multitron Pro, усредненные значения выхода лежали уже в пределах 276 мкг/мл.

После получения таких эффективных результатов были проведены испытания белков различного типа, в ходе которых было установлено, что тенденция к росту выхода имеет постоянный характер и не зависит от целевых показателей.

INFORS HT Multitron Pro показывает прирост клеток на стандартном уровне в сравнении с колбами орбитального действия. В то же время, клетки, культивированные в крутящемся шейкере при колебаниях 25 мм и перемешивании при 400 мин-1, не показали особого прироста. Это объясняется различным объемом переносимого в процессе кислорода.

В процессе культивирования клеток в INFORS HT Multitron Pro обеспечивалась их возросшая жизнеспособность, сравниваемая с культурами, получаемыми в колбах вращающегося типа. При применении орбитального шейкера этот параметр показал снижение уже через день после произведенного засева и снижался на протяжении всего времени испытания.

При сравнении трех разных уплотнений не было обнаружено никаких различий в показателях белкового выхода. А вот при изменении объема отличия в концентрации белка наблюдались — при наполнении ячеек 500 мкл пробы она была выше, чем при рабочих объемах 1000 мкл. При этом эксперименты велись в различных условиях. Однако при использовании планшета с вместимостью 1000 мкл получался более высокий выход белка. Это объясняется разницей используемых исходных объемов. Помимо этого, если скорость перемешивания увеличивали в процессе с 800 до 1000 мин-1, то параметры выхода также возрастали.

Как определялась скорость испарения

Для ее определения производилось сравнение нескольких параметров испарения при герметизации разного типа. Для этого использовались газонепроницаемый уплотнитель Axygen Scientific, Microplate Box производства INFORS HT и Duetz-System от Kuehner Technology. Для расчетов брались изменения массы всех используемых микропланшетов в течение 5 дней, которые затем рассчитывались при помощи линейной регрессии. После чего полученный результат делился на общее количество лунок в планшете, чтобы получить значение испарения для одной лунки. Объем заполнения каждой ячейки составлял 1000 мкл, пробы перемешивались на скорости 1000 мин-1 при амплитуде 3 мм. Влажность в рабочей камере инкубатора была на уровне 75%.

Параллельно производились испытания трех типов микропланшетной герметизации, которые являлись коммерчески доступными. В итоге были обнаружены крупные различия остаточного объема проб, которые культивировались на протяжении пяти дней в системе INFORS HT Multitron Pro. Меньшую испаряемость показала система Duetz, которая была герметизирована Microplate Box (INFORS HT).

Наибольшие потери на испарение были выявлены там, где применялись мембранные уплотнители — около 30-40% (в зависимости от формата получения культур).

Применение INFORS HT Multitron Pro позволяет существенно повысить выход белков рекомбинантного типа и снизить разброс получаемых данных в каждой ячейке микропланшета (в сравнении с процессами, проводимыми при амплитуде 25 мм). Клеточные культуры получаются более жизнеспособными и лучше растут благодаря оптимально подобранной циркуляции среды. Проведены исследования культивации при различных параметрах: скорость перемешивания, системы герметизации микропланшетов и объем заполнения. В результате было выявлено, что наиболее оптимальными параметрами являются следующие: перемешивание пробы объемом 1000 мкл при скорости 1000 мин-1 и колебательных движениях амплитудой 3 мм. При этом выход стал значительно больше при применении мембранных уплотнителей с Рeg Тray.

Это наглядно показывает выгодность применения системы INFORS HT Multitron Pro для увеличения экспрессии белка.

Помимо этой системы, компания предоставляет еще множество практичных решений для эффективной работы.

Другие новости